Kurzbeschreibung
Der Cytek® Aurora CS ist ein Durchflusszellsortierer, der auf Gesamtspektrumprofilen basiert. Dabei können 96-well-Platten oder Einzelröhrchen verwendet werden. Aurora CS enthält eine feste optische Baugruppe mit die mit bis zu fünf räumlich getrennten Laserstrahlen konfiguriert werden räumlich getrennten Laserstrahlen.
Basismodell mit Drei-Laser-Konfiguration: 405 nm: 100 mW, 488 nm: 50 mW, 640 nm: 80 mW. Laserverzögerungen werden während der Qualitätskontrolle des Geräts automatisch angepasst. Das Ergebnis ist ein System, das eine hohe Auflösung auf Einzelzellebene bietet, um die schwierigsten Zellpopulationen aufzulösen, wie z.B. Zellen mit hoher Autofluoreszenz oder geringer Expression von wichtigen Biomarkern, unabhängig von der Komplexität des Assays, und um lebende Zellen für nachgeschaltete Studien zu isolieren. Es können bis zu 6 verschiedene Zelltypen sortiert werden. Zur Datenanalyse wird die Software SpectroFlo® CS Software Acquisition Workflows verwendet.
Ansprechperson
Dieter Liebhart
Research Services
Sortierung und Charaktersierung von Vogelzellen im Rahmen der verfügbaren Antikörper, sowie Expressionsanalysen.
Methoden & Expertise zur Forschungsinfrastruktur
Vor allem mononukleäre Zellen werden aus spezifisch pathogenfreien (SPF) Hühnern gewonnen. Diese Hühner werden sorgfältig in einer kontrollierten Umgebung gehalten, um ihre Gesundheit und Pathogenfreiheit zu gewährleisten, wodurch sie für unsere Forschungsuntersuchung gut geeignet sind. Die Abtrennung der Zellen wird mittels Gradientenunterschiede durchgeführt. Kurz gesagt, werden z.B. 10 ml Blut aus der Jugularvene entnommen und sofort in Blutentnahmeröhrchen mit Heparinsulfat übertragen. Das Blut wird dann mit einem gleichen Volumen an kaltem PBS+2% FCS gemischt. Die vorbereitete Suspension wird langsam über ein doppeltes Volumen Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich) für die Dichtegradientenzentrifugation geschichtet, die bei 400×g für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Die Zellen aus der Interphasenschicht werden gesammelt und mit kaltem PBS+2% FCS gewaschen, bevor die isolierten PBMCs in kaltem PBS+2% FCS resuspendiert werden. Anschließend werden die isolierten Zellen einem ersten Färbeverfahren mit primären Antikörpern unterzogen, bei dem monoklonale Antikörper gegen CD45, CD8α, CD4 und TCR-γδ aus der Maus verwendet werden. Dieses Färbeverfahren wird 20 Minuten lang bei 4 °C durchgeführt. Nach diesem Färbeschritt werden wir das Cytek® Aurora CS System für die Sortierung der Zellen verwenden. Die sortierten Zellen werden verschiedenen Behandlungen unterzogen, darunter keine Stimulation (unstimuliert) oder Stimulation mit LPS und/oder PMA/Ionomycin. Nach erfolgter Stimulation wird die Zytokinexpression der Zellen gemessen. Somit können einzelne Populationen von Zellen separat untersucht werden.